TLC薄层色谱板细胞粘附腔

型号:glycotech 31-007
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品牌:glycotech

TLC薄层色谱板细胞粘附腔

细胞表面的碳水化合物可作为te定识别分子,用于某些细胞之间的细胞间粘附。

糖鞘脂代表一组细胞表面糖缀合物,可通过薄层色谱法轻松分离和分析。 细胞粘附室经过专门设计,可直接在薄层色谱图中分离的糖鞘脂上直接检测细胞粘附。

将细胞直接在TLC板上离心以形成与色谱糖鞘脂的立即紧密接触。 结合的细胞的位置对应于糖鞘脂配体的Rf值,其可用于功能性碳水化合物序列的纯化和结构表征。

此程序允许检测te定细胞对TLC板上分离的糖脂的粘附。 步骤包括:

(1)糖缀合物的HPTLC,

(2)用聚合物包被色谱图,

(3)预封闭色谱图以减少非te异性细胞结合,

(4)将色谱图安装在丙烯酸室中,

(5)添加标记的 

(6)孵育,

(7)通过离心去除非贴壁细胞,

以及(8)固定贴壁细胞以进行检测。 固定之前,贴壁细胞永远不会通过气/液界面,即使黏附强度很低,也可以检测te定的细胞黏附。


材料:

  • 压克力粘合箱
  • 丙烯酸转移皿玻璃底二氧化硅HPTLC板
  • 聚甲基丙烯酸异丁酯
  • 氯仿
  • 正己烷
  • 缓冲细胞培养基
  • 牛血清白蛋白(BSA)
  • 磷酸盐缓冲溶液
  • 在冰上放射性标记(或以其他方式标记)的细胞悬浮液
  • 150mm培养皿
  • 戊二醛
  • X射线胶片(或备用细胞检测系统)

Protocol:

1.将预先压制的10 x 10 cm HPTLC板沿一个刻痕破碎,以生成5 cm x 10 cm的板。应用糖脂,并使用标准程序开发TLC。然后将色谱图彻底干燥(50°C,1小时),并冷却,然后再涂覆聚合物。

2.将聚甲基丙烯酸异丁酯(参见99页)制成10%(w / v)的氯仿溶液,将其以1/100的比例稀释到快速搅拌的己烷中,生成1 mg / ml的储备液,可在室温下保存。取决于细胞类型,使用前应立即用另外的己烷将溶液进一步稀释至2-200 ?g / ml的终浓度。依次将已显影和干燥的TLC板浸入30秒钟。分别在己烷中,然后在PIBM溶液中,然后风干。

3.将涂有PIBM的板浸入培养基中直至湿润,然后转移至含有封闭剂0.5 mg / ml BSA的培养基中30分钟,然后转移至wu封闭剂的培养基中。

4.将预封闭的板吸附剂面朝下放在粘附室的垫片上。将介质吸移到TLC板的背面,并施加橡胶垫圈,以使气泡从板垫圈的接触区域中排除。垫圈和丙烯酸盖用随附的螺钉固定在适当的位置。

5.捕获在腔室中的介质通过腔室末端的鲁尔锁孔倒出。将含有1-5 mg / ml BSA的培养基中的细胞悬浮液(105-106个细胞/ ml)吸移到一个开口中,直到腔室装满并且没有气泡(腔室容量15 ml)。端部开口用鲁尔锁密封,密封盒的TLC吸附剂一面朝上放置,从而使细胞沉降到板表面上。将盒子放在微孔板离心机上,以30xg离心3分钟。使细胞与TLC板表面接触。

6.将反应室浸入(通常将吸附剂朝上)在37°C的水浴中30分钟。使发生粘附。

7.将室从水浴中移出,倒置,放置(吸附剂面朝下)在离心机载体中,并在4℃下(250-500xg,10min。)离心以从TLC板表面除去非粘附细胞。

8.仍然倒置时,将腔室完浸入PBS的冰冷桶中,取下盖子和垫圈,然后轻轻取下TLC板,将其对正(浸入)并放在转移盘中。然后,将充满液体的培养皿用于通过两个装有PBS的150 mm培养皿转移TLC板以进行洗涤。

9.仍然在转移皿中,将板置于空的150mm培养皿中,并在环境温度下用100-150ml 2%戊二醛的PBS溶液轻轻覆盖30分钟。

10.将TLC板从转移皿中取出,通过浸入PBS中洗涤并垂直放置以干燥。

11.将完干燥的板放在X射线胶片上并曝光。暴露1-24小时后。冲洗胶片以检测粘附细胞的位置。

注意:如果糖脂存在的浓度足够(> 500 pmol / lane),则放射自显影后可通过将板在甲醇,水(1:5)中于考马斯蓝(0.3mg / ml)中温育30次而在TLC板上检测到。分钟然后在相同的溶剂混合物中脱色5分钟。考马斯亮蓝处理还使粘附细胞染色,可以通过放射线显微镜在放射自显影带的位点观察到粘附细胞,以确认检测到的放射性标记与完整细胞粘附相对应。

References:

(1) Swank-Hill, P., Needham, L.K., and Schnaar, R.L. (1987) Carbohydrate-specific cell adhesion directly to glycosphingolipids separated on thin-layer chromatography plates. Analytical Biochemistry, 163: 27-35

(2) Stroud, M.R., Handa, K., Ito, K., Saylan, M.E.K., Fang, H., Levery, S.B., Hakomori, S., Reinhold, B.B., and V.N.Reinhold (1995) Myeloglycan, a series of E-selectin-binding polylactosaminolipids found in normal human leukocytes and myelocytic leukemin HL-60 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 209: 777-787.


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