FRET荧光共振能量转移显微镜，Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy

荧光共振能量转移 (FRET) ^*是一种依赖于距离的物理过程，通过该过程，能量通过分子间远程偶极-偶极耦合从激发的分子荧光团（供体）非辐射地转移到另一个荧光团（受体）

在帮助阐明活细胞中的动态蛋白质相互作用方面显示出相当大的前景

荧光共振能量转移 (FRET) 是一种强大的物理现象，广泛应用于生物医学研究和药物发现。FRET 技术涉及能量从荧光供体分子到受体分子的wu辐射传输。供体分子是zui初吸收能量的发色团或染料，而受体是能量转移到的弟二个发色团。能量转移降低了供体的荧光强度并增加了受体的发射强度。这种相互作用对距离敏感，发生的距离（通常为 10-100 ?）大于原子间距离。由于其对距离的敏感性，荧光共振能量转移显微镜已被用于观察分子相互作用、核酸折叠、细胞凋亡事件、

原则

荧光共振能量转移涉及供体荧光团，该供体荧光团通过远程偶极-偶极相互作用将其激发能量非辐射地转移到附近的受体分子。能量转移技术基于将激发的荧光团视为振荡偶极子的概念，该偶极子可以与具有相似共振频率的弟二个偶极子交换能量。有效的 FRET 需要满足三个条件。首先，供体发射光谱和受体激发光谱的“光谱重叠”。其次，发色团应该彼此靠近。距离依赖性对于检测蛋白质-蛋白质相互作用至关重要。弟三，供体和受体的偶极子应该对齐。当满足 FRET 的条件时，能量转移完成。通过共振能量转移，不会发射光子，而是将能量转移到受体荧光团，其电子通过吸收能量而被激发。受体荧光团在返回基态时发射光子。

仪器

荧光共振能量转移 (FRET) 显微镜由光源、倒置光学显微镜、物镜、荧光滤光片和棱镜组成。FRET 显微镜配备标准卤钨灯，可使用传统的明场、相差或微分干涉相差 (DIC) 照明检查和记录细胞。这两种对比度增强技术可以与荧光相结合，以揭示感兴趣的标本中荧光团的空间位置。标准 CCD 相机连接到显微镜以捕获荧光图像 

可视化分子相互作用的程序

1. 将感兴趣的细胞放在清洁的玻璃盖玻片上。
2. 一天后，用 FRET 构建体（荧光团融合）转染细胞。
3. 将参考细胞与感兴趣的细胞一起放在盖玻片上。Trypsinize 细胞和种子到 6 孔板中的盖玻片上，每孔 200,000 个细胞。让它们附着并扩散 2 小时。
4. 将含有细胞的盖玻片转移到适合活细胞成像的腔室中
5. 将保持室放在显微镜上并观察细胞。

可视化单分子的程序

1. 将细胞放在wu菌玻璃盖玻片上。
2. 一天后，用 FRET 传感器结构转染细胞。
3. 将带有细胞的盖玻片转移到盖玻片室。
4. 将其放在显微镜上观察。
5. 聚焦并定位表达传感器构造的健康细胞。
6. 调整和you化空间分辨率、信噪比和漂白/光毒性效应。
7. 获取供体和受体的激发和发射图像。

测量半胱天冬酶活性的方案

细胞制备

1. 在玻璃底板的细胞生长培养基中表达基于 FRET 的 caspase 记者的细胞。
2. 在 37°C 下孵育细胞一天，使细胞粘附在玻璃表面。
3. 在细胞成像前至少 1 小时打开显微镜并将温度设置为 37°C。
4. 用预热至 37°C 的细胞生长培养基更换培养基。
5. 在细胞成像前 30 分钟将腔室载玻片放在显微镜载物台上。
6. 打开 CO2 源。
7. 定位并聚焦样品中感兴趣的细胞。

图像调整

8. 调整用于捕获供体激发/发射、供体激发/受体发射和受体激发/发射的仪器。
9. 使用表达可裂解 caspase FRET 探针的细胞设置采集设置。
10. 调整供体通道和受体通道，以分别在未经处理的细胞中提供低信号和高强度。
11. 每 1–2 分钟捕获一次图像以记录快速下游事件。

半胱天冬酶活性的检测

1. 选择多个视野。
2. 启动延时成像。
3. 在治疗前对细胞进行 10-20 次循环成像。
4. 用选定的凋亡刺激处理细胞，并记下添加刺激的时间。
5. 重复实验以验证发现。

应用

可视化两个分子之间的分子相互作用

荧光共振能量转移（FRET）是一种距离特定的物理技术，广泛用于测量和观察分子相互作用。在这项研究中，获得了由短 DNA 分子连接的供体和受体荧光团的发射光谱。测量单个四甲基罗丹明（供体）和单个红色分子（受体）之间的能量转移，该红色分子连接到杂交的长度为 10 或 20 个碱基的 cDNA 的 5' 端。该研究表明，FRET 是一种强大的技术，可以测量单个供体-受体对之间的能量转移。单分子 FRET 有可能扩展到执行基于溶液的测量，在那里它可能成为动态测量的重要技术，例如监测生物大分子的构象变化。将来，

监测活细胞中的蛋白水解活性

蛋白酶是一种蛋白质裂解酶，与许多正常的生物过程以及癌症、中风和感染等疾病密切相关。在这项研究中，发光量子点 (QD) 生物偶联物被用于使用荧光共振能量转移来检测蛋白水解活性。为此，开发了模块化肽结构，将蛋白酶 caspase-1、胶原酶、凝血酶和胰凝乳蛋白酶的染料标记底物连接到量子点表面。荧光共振能量转移和蛋白水解测定是在过量酶和底物条件下进行的。收集了酶促速度、动力学参数和酶促抑制机制的定量数据。

成像蛋白质-蛋白质相互作用

荧光共振能量转移显微镜也用于绘制体内蛋白质-蛋白质相互作用图。为此，使用与抗体缀合的 Cy3-Cy5 供体-受体对。目的蛋白直接用一抗标记，阳性对照用二抗标记。在 FRET 显微镜下观察蛋白质的相互作用。通过测量供体荧光猝灭和受体荧光团激发的释放来量化能量转移效率。经验证，与其他成像技术相比，FRET 可适用于以更高的效率测量蛋白质-蛋白质相互作用。

检测核酸杂交

互补寡脱氧核苷酸的杂交可以通过非辐射荧光共振能量转移来测量。在这项研究中，荧光素（供体分子）和罗丹明（受体分子）共价连接到多种长度的互补脱氧核苷酸的 5' 端。通过荧光素发射强度的降低和罗丹明发射强度的增加来检测互补寡脱氧核苷酸杂交后的能量转移。发现荧光素发射强度淬灭了 26%。传输效率为 5 ⁰C 从 0.50 降低到 0.22 再到 0.04，供体和受体荧光团之间的距离增加 8 到 12 到 16 个核苷酸。这些结果表明荧光调制和非辐射荧光共振能量转移适用于溶液中核酸杂交的检测。随着进一步的发展，这些技术可被证明可用于活细胞中核酸杂交的定量。

防范措施

• 在使用合适的波长进行 FRET 测量进行标记之前，测量样品的背景荧光强度。
• 供体荧光团的荧光强度应在荧光发射随荧光团浓度变化的范围内。
• 供体的荧光强度应在受体标记的补体存在的情况下确定。
• 小心地用荧光标签标记蛋白质，因为它对 FRET 的效率至关重要。
• 仔细监测和控制供体和受体荧光团的浓度。
• 消除光漂白，因为它可以改变供体与受体的分子比例。
• 荧光团的发射波长必须与检测器的灵敏度范围相匹配。

you势和局限性

• 荧光共振能量转移显微镜是一种强大的技术，可以测量 10-75 ? 之间的分子间距离。
  • 由于具有很强的距离依赖性，荧光共振能量转移技术可以作为分光尺使用。
  • 测定的值和测量值直接从 FRET 获得，它们的直方图提供了有关 FRET 值分布的有价值信息。
  • FRET广泛用于蛋白质结构、构象、空间分布和组装的观察和检测。
  • 通过使用 FRET 确定其动力学参数，可以在空间和时间上观察生化反应。
  • FRET 显微镜仅限于检测非常接近的分子和相互作用的分子。