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实时荧光定量PCR技术服务(Real Time-PCR,RT-PCR)
实时荧光定量PCR(Real Time PCR,RT PCR)服务
世联博研生命科学服务中心提供快捷高效的实时荧光定量PCR(Real Time PCR,RT PCR)服务，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。是一个常用的mRNA水平的基因表达定量技术。
服务内容
- 细胞/组织的基因差异表达检测，经过不同处理样本之间te定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，te定基因在不同时段的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。
- 组织/细胞样品中基因拷贝数的确定，DNA或RNA的相对和绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。
- 基因分型，基因突变及多态性方面的研究。
收费标准
- 抽提样品DNA或RNA：细胞样品 40元/样本；组织样本 60元/样本
- 引物/TaqMan探针设计与合成：you化引物/探针设计及合成 （探针法）每个基因 1100元；you化引物设计及合成 （染料法）每个基因 100元
- RT反应：RNA反转录成cDNA 25元/样本
- 预实验：荧光PCR体系you化。确定荧光PCR反应条件300元/基因
- 标准曲线制作：标准品为PCR产物300元 标准品为质粒400元
- 正式实验：荧光PCR检测。30元/反应
服务周期
1. 从细胞或te定组织中提取总RNA：实验周期为细胞或组织送到后的2个工作日。
2. 逆转录实验：实验周期为1个工作日。
3. 扩增内参和目的基因，实验周期为10个工作日。因为在每种不同细胞或组织中不同的基因的扩增难度有差异，因此实验的时间会有所不同。我们一般会根据实验进程通知客户，确保客户在时间知道实验状况。
4. 回收内参和目的基因表达片段做标准样，并检测其扩增效果： 实验周期为2个工作日。
5. 上机Real Time-PCR检测得到结果并进行处理： 实验周期为2个工作日。
客户须知
1. 进行mRNA表达量分析时，如果提供的材料为Total RNA，请寄送足量的并且保证纯度的Total RNA(浓度在200 ng/μl以上，体积在20 μl 以上，纯度A260/280在1.8-2.0间)。如果目的基因表达量低时，应尽量提供更高浓度的Total RNA。
2. 如果提供的材料为细胞或组织，DNA、RNA的提取费用另收（参照DNA/RNA抽提服务）。 同时应保证材料新鲜，动物细胞数为106以上，动物组织为100 mg以上。
3. 目的基因信息(GenBank Acc、Gene ID、关键词)，mRNA需说明具体剪接子及检测范围（公共区域或te异性区域）。
4. 引物设计的区域范围(序列、5′端序列、3′端序列)。我们可免费提供引物和TaqMan探针设计服务，合成费用由客户支付。
5. 确定准确的靶序列数量，以准确定量的靶序列作为参照，好是以质粒的形式提供。检测工作完毕后，本公司会将检测结果和相关图片反馈给客户。
6. 客户应对所提供的材料及信息负责，如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或经济损失由客户承担。
服务程序
1. 可在我公司网站内直接填写《Real Time-PCR服务订单》发至我公司邮箱。
2. 可下载订单，填写完成后，用传真的形式发到我公司。
3. 可电话联系详谈有关具体要求和服务内容。
4. 签订《Real Time-PCR服务合同》，预付实验总费用的50%作为实验预付款。
5. 寄送：委托单位的试验材料和试剂等均须采用te快专递形式邮寄，有低温要求的、固定要求的，按低温保存、固定防碎方法运输，以确保实验物品的安可靠。
6. 实验结束后，本公司将结果及时发给客户，同时根据客户要求处理相关材料。
7. 客户应对所提供的材料及信息负责，如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或经济损失由客户承担。
服务咨询及技术支持
- 电话:
- Email: SLBY800@163.COM
技术原理
Real-time PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR技术具有te异性强，有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点，做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定Ct值，从而根据Ct值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。
技术流程
一、RNA的提取
二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA
三、RNA琼脂糖凝胶电泳
四、RNA反转录为cDNA
Real-Time PCR引物设计的要求
① Tm=55~65 ℃
② GC=30~80%
③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80~300 bp之间都可。
④ 引物的退火温度要高，一般要在60 ℃以上。
五、cDNA与引物质量检测
选择te异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。
六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况：
常用的看家基因有β-actin，GAPDH，18S rRNA
七、定量 PCR检测
八、扩增曲线和溶解曲线
溶解曲线部为单峰表明为te异性扩增，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。
