免疫是人类健康的第一道防线，是防卫病原体入侵最有效的武器。今天谈谈细菌或古生菌的免疫。细菌免疫系统CRISPR-Cas的发现引发了技术革命浪潮并产生了极大的社会影响。

新发现的Cas12/Cas13/Cas14不同于Cas9，使得CRISPR系统在病原体的快速诊断和肿瘤基因检测领域的应用成为可能，本期我们重点关注“新魔剪”Cas12a，看看它如何疯狂切割单链DNA，实现对肿瘤基因或特定病原体的检测。

CRISPR-Cas系统背景回放

面对噬菌体的威胁，细菌进化出了一套专门针对噬菌体或外源性遗传物质的CRISPR-Cas免疫系统。CRISPR全称为“簇状、规律间隔的、短回文重复序列”（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），是由众多短而保守的重复序列区（repeat）和间隔区（spacer）组成。如图1所示： Repeat是细菌固有序列，能够同时结合Cas蛋白和spacer的序列，而spacer则是细菌（或是其祖先）感染过的病毒序列。一旦噬菌体感染发生，绝大多数的细菌死亡，极少部分的细菌由于其基因变异得以生存。这些细菌中的一部分，将噬菌体的DNA序列切割后，插入repeat区域中，形成spacer，从而获得类似高等生物“免疫记忆”的能力。

图解CRISPR-Cas系统获得性免疫的机制

（Van Der Oost J， Westra  ER，et al. 2014)

随着CRISPR-Cas机理的逐步揭示和新的Cas酶（Cas12/Cas13/Cas14）的发现，科学家们发现这个系统非常强大，可以精准高效地实现基因编辑，比如对某个基因的敲除、插入和替换等。而CRISPR系统的序列特异性识别能力已经被应用在越来越多的领域，如医药，食品，农业和工业生物技术等，这些应用很大程度上都是以Cas9为基础进行开发的，而新发现的Cas12/Cas13/Cas14不同于Cas9，使得CRISPR系统在病原体的快速诊断和肿瘤基因检测领域的应用成为可能。

Cas12a-单链DNA的“新魔剪”

今年4月，有CRISPR女神之称的Jennifer Doudna 教授在《Science》撰文指出Cas12酶家族在gRNA的引导下与目标序列结合以后，便会切换为激活状态，疯狂的切割体系内其它的单链DNA。Cas12a这一特点可被用于分子诊断领域，实现对肿瘤基因或特定病原体的检测。在体系内加入含有报告基团的单链底物后，如果Cas12a识别到靶序列（目标病原体或肿瘤基因）的存在，就会切割单链底物从而释放荧光报告基团。

Cas12a具有靶向切割单链DNA活性及附带切割特点

(Chen JS，  Ma E，  et al. 2018)

Cas12a可以实现HPV的准确分型

但是如果样本中的目标基因含量非常少，Cas12a与gRNA复合物匹配到需检测靶序列的概率很低。此时就需要先扩增靶序列，提高需要检测底物的丰度。PCR（聚合酶链式反应）是常用于这一目的扩增手段，但是需要专门的PCR仪进行温控反应。而另外一种信号扩增技术——重组聚合酶扩增（RPA），可以在恒温状态下实现信号的扩增，而不需要复杂的升温降温过程。Doudna教授创新性的将Cas12a靶向切割单链DNA的特性与RPA技术联合起来，开发了一种名为DETECTR的技术（DNA Endonuclease-Targeted Crispr Trans Reporter）。研究结果表明，肛拭子取样后等温扩增10分钟，使用Cas12a系统对扩增产物进行检测，可以在1小时内检测到人乳头瘤病毒（HPV）并准确区分两种相似的亚型，HPV16和HPV18。DETECTR技术的开发为实现病原体或肿瘤基因的即时检验（POCT） 又提供了一个强有力的支撑平台。

研究者基于CRISPR-Cas12a联合 RPA技术开发的

DETECTR技术(Chen JS，  Ma E，  et al. 2018)

那CRISPR-Cas12a与CRISPR-Cas9有什么区别呢？ Cas9是最早发现的Cas酶之一，也是目前为止研究最深入和应用最广泛的Cas酶，在基因编辑、疾病治疗等方面的应用前景巨大。然而CRISPR-Cas9缺乏切割单链核酸的酶活结构域，无法用于体外检测。而Cas12/13/14则普遍存在第二个酶活结构域，当蛋白正确结合到靶向序列时，能够激活这一结构域，切割探针小分子，实现从待检序列信息到荧光信号的转化。基于它们的这一特点，在医学检测领域需要靶向检测已知序列的情况下，能够实现普通实时定量PCR所无法达到的灵敏度，摆脱对实时定量PCR仪的依赖。(生物谷世联博研Bioexcellence）

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